Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Básicas de la Universidad de Pamplona

Análisis Cinético del proceso de termo inactivación de la Aminoacilasa I
Kinetic analysys of the thermal inactivation process in Aminoacilase I

Autores: Alfonso Quijano Parra 1, Ph.D, Chukhrai.E.S,2 Dr
1.- Universidad de Pamplona, Facultad de Ciencias Básicas, Departamento de Química, Grupo de Investigación en Química.
2.-Universidad Estatal de Moscú “M.V. Lomonosov”. Facultad de Química. Departamento de Cinética y Catálisis. Moscú.

Resumen

De todos los métodos de separación de los racematos de los aminoácidos D y L el que tiene mayor aplicabilidad es la hidrólisis estereoselectiva de N-acil aminoácidos por diferentes Acilasas

La Acilasa I (C.E.3.5.1.14) es un dímero con una masa molecular de 85500 y cada subunidad está constituida por 772 aa.

La importancia práctica de esta enzima es la gran esteroespecificidad en relación con los derivados acilicos de N-aminoacidos.

Las Acilasas de diferente origen tienen una amplia aplicación en  biotecnología para la separación de mezclas racémicas de aminoácidos en forma de catalizadores heterogéneos insolubles.

La Acilasa I es una enzima dimérica y  la cinética de termo inactivación de las enzimas diméricas se realiza en dos etapas y corresponde al mecanismo cinético de termo inactivación disociactiva  de un dímero activo, que se disocia fácil y reversiblemente en subunidades inactivas.

Objetivo: Estudiar las propiedades del proceso de asociación-disociación de la Acilasa I y la termo inactivacion de la Acilasa I

Materiales y métodos: Se utilizo un preparado de Aminoacilasa I de riñones de cerdo de la firma Reanal.-El sustrato utilizado es el N-acetil-D-L Metionina de la firma Fluka. La actividad de la acilasa I se determinó en el espectrofotómetro Hitachi 124 a 238 nm. La concentración del sustrato fue de 0.2  M en 0.15 M tampón fosfato pH 7,25.

Resultados: La actividad especifica de la acilasa I disminuye con el aumento de la concentración de la Enzima, esto está relacionado con  la asociación de la Acilasa I en formas menos activas de la Enzima

Se estudio el esquema cinético de termo inactivación de la enzima dimerica –Acilasa I que incluye la disociación reversible del dímero activo en monómeros inactivos y la inactivación de los monómeros. Se calculan los parámetros cinéticos característicos de la termo inactivación de una enzima dimerica .

Se estudia la influencia del producto de la reacción L Metionina en los procesos asociativos disociativos de la Acilasa I.

Conclusiones:

La acilasa I es un  enzima  asociativa del tipo alostèrico.- La L-Metionina activa la reacción catalizada por la Acilasa I , la activación se logra como resultado de la disociación de formas oligomericas inactivas de la Acilasa I hasta el dimero activo para concentraciones altas de L-Metionina

Se  amplia el marco del análisis cinético de los procesos de inactivación de sistemas complejos, los cuales  no se pueden describir completamente por los esquemas cinéticos

Palabras clave:  Acilasa I,  Metionina, mezcla racémica,  denaturación, estructura dimérica, monómero inactivo,  cinética de la termo inactivación

Abstracts

In all the methods of separation for the rasemic mix in the amino-acids D and L having major applicability the hydrolysis stereo-selective process for N-acil amino-acids by different Acilases.

The Acilase (C.E.3.5.1.14) is a dimer with the molecular mass of 85500 and each sub-unit is constituted by 772 aa.

The practical importance of this enzyme is the great stereo-specificity in relation to the acylic derivation of N-amino-acids.

The Acilases with different origins have a wide application in bio-technology for the separation of rasemic mixtures of amino-acids in the form of insoluble heterogeneous catalysers.

 The Acilase I is a dimeric enzyme and the Kinetics of the thermal inactivation of the dimeric enzymes is done in two stages and corresponds to the Kinetic mechanism of the disociactive thermal inactivation of an active dimer which easily dissociates and is reversible in inactive sub-units. 

OBJECTIVE:  To study the properties of the process of association – dissociation of the Acilase I and the Thermal Inactivation of the Acilase I.

MATERIALS AND METHODS: A preparation was used of Amino-acilase I with pig kidneys from the Reanal firm.  The substrate used is the N-acetil-D-L Metionine from the firm Fluka.  The activity of the acilase I was determined in the spectrophotometer Hitachi 124 at 238 nm.  The concentration of the substrate was at 0.2 M in 0.15M phosphate tampon – pH 7.25.

RESULTS:  The specific activity of the acilase I reduces with the increases of the concentration of the Enzyme; this is related to the association of the Acilase I in less active forms of the Enzyme.

The Kinetic scheme was studied with the thermal inactivation of the dimeric enzyme – Acilase I that includes the reversible dissociation of the active dimmer in inactive monomers.  The characteristics of the Kinetic parameters were calculated for thermal inactivation of a dimeric enzyme.

The study influences the product of the reaction L Metionine in the associative-dissociative processes of the Acilase I.

CONCLUSIONS:  The Acilase I is an associative enzyme of the allosteric type.  The L-Metionine activates the reaction catalyzed by the Acilase I; the activation is achieved as a result of the dissociation of the inactive oligomeric forms of the Acilase I reaching the active dimmer for high concentrations of L-Metionine.

The Kinetic analysis is amplified with the processes of inactivation with complex systems which cannot be completely described by Kinetic schemes.

KEY WORDS:  Acilase I, Metionine, Rasemic Mixture, denaturation, dimeric structure, inactive monomer, Kinetic Thermal inactivation.

* Para citar este articulo: Quijano Parra A, Chukhrai.E.S . Análisis Cinético del proceso de termo inactivación de la Aminoacilasa I .2010;8(2):-

+Autor para el envio de correspondencia y la solicitud de separatas: Grupo de Investigación en Química. Departamento de Química . Facultad de Ciencias Básicas, Universidad de Pamplona,

 E-mail:quijanoparra@gmail.com